O QUE É PCR REAL TIME?

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O QUE É PCR REAL TIME?

Atualmente, as técnicas de amplificação e detecção de ácidos nucleicos estão entre as ferramentas mais valiosas na pesquisa biológica. Cientistas em todas as áreas da ciência da vida - pesquisa básica, biotecnologia, medicina, ciência forense, diagnósticos e muito mais - utilizam esses métodos em uma ampla gama de aplicações. A PCR ou Reação em Cadeia da Polimerase se tornou a pedra angular da biologia molecular moderna em todo o mundo. A PCR Real Time (qPCR ou PCR em Tempo Real) é uma forma avançada da Reação em Cadeia da Polimerase que maximiza o potencial da técnica.

Como o nome sugere, a PCR Real Time é uma técnica usada para monitorar o progresso de uma reação de PCR em tempo real. Ao mesmo tempo, uma quantidade relativamente pequena de produto de PCR (DNA, cDNA ou RNA) pode ser quantificada. A PCR Real Time baseia-se na detecção da fluorescência emitida por uma molécula repórter que aumenta à medida que a reação avança. O aumento da fluorescência ocorre devido ao acúmulo do produto de PCR (fragmento alvo) a cada ciclo de amplificação. A PCR Real Time facilita o monitoramento da reação à medida que ela progride. Pode-se detectar quantidades extremamente mínimas de ácido nucleico do patógeno investigado e quantificar o produto final com precisão. Além disso, não há necessidade do processamento pós-PCR, como ocorre no PCR convencional, fator esse que evita contaminação e economiza recursos e tempo. Estas vantagens da técnica de PCR Real Time baseada em fluorescência revolucionaram completamente a abordagem da quantificação do DNA e RNA baseada em PCR. Os testes de PCR Real Time são fáceis de executar, apresentam sensibilidade e especificidade bastante elevadas, e fornecem escopo para automação. A PCR Real Time é também referida como RT-qPCR quando é inserido ciclo adicional de transcrição reversa, que leva à formação de uma molécula de DNA a partir de uma molécula de RNA. Isso é feito porque o RNA é menos estável em comparação ao DNA.

De forma geral, a PCR Real Time representa uma valiosa ferramenta diagnóstica de alto fator tecnológico agregado. Além de permitir detecção precoce de agentes infecciosos em animais doentes, o teste exibe grande precisão diagnóstica e viabiliza detecção múltipla de patógenos relacionados a um problema comum.

 

QUAL A DIFERENÇA ENTRE PCR REAL TIME E PCR CONVENCIONAL?

A Reação em Cadeia da Polimerase convencional (PCR ou cPCR) foi desenvolvida em 1983 por Kary Banks Mullis. A técnica produz um grande número de cópias de uma determinada sequência de DNA alvo para diversas análises. O método revolucionou a biologia molecular, mas foi apenas um ponto de partida para inúmeros outros aprimoramentos que atualmente substituem a PCR convencional com inúmeras vantagens.

Algumas limitações da técnica cPCR podem afetar sua aplicabilidade diagnóstica. A classificação como detecção end-point significa que a cPCR demanda uma etapa extra após a amplificação que corresponde à eletroforese em gel de agarose. O resultado é apenas qualitativo (não permite quantificação). O positivo é constatado positivo mediante visualização de banda no gel com o tamanho correspondente ao fragmento amplificado. Ocorre que, a resolução do gel de agarose é muito pobre e soma-se a isso, o fato de haver baixa precisão na discriminação de tamanho dos fragmentos amplificados. Além disso, o processo demanda muito tempo, o que inviabiliza prazos curtos de liberação de resultados.

Em adição à baixa precisão e resolução, a cPCR é bem menos sensível que as técnicas mais modernas para diagnóstico molecular. Outros limitantes correspondem ao processamento pós-PCR e ausência de automação, fatores que aumentam muito a chance de contaminação.

Em contrapartida, a PCR Real Time (qPCR), considerada uma variação da técnica convencional, representa a melhor ferramenta para diagnóstico molecular. O método é vinculado a um sistema de monitoramento que quantifica emissão de fluorescência produzida durante os ciclos de amplificação. A qPCR viabiliza amplificação, detecção e quantificação simultaneamente, agilizando a obtenção de resultados e minimizando o risco decorrente de possíveis contaminações. O processo é rápido e permite inclusive a detecção múltipla de sequências-alvo em uma mesma amostra (qPCR Multiplex). Comparado à cPCR, a PCR Real time apresenta maior reprodutibilidade, especificidade, sensibilidade, precisão e acurácia diagnóstica, além de também reproduzir resultados quantitativos, que são importantes para acompanhamento de evolução clínica e infecciosa, avaliação de eficácia terapêutica e inferência para interferência vacinal a partir de cepas atenuadas.

 

TRÊS DICAS PARA A INTEPRETAÇÃO DE RESULTADOS DE EXAMES DE PCR REAL TIME

Esse conteúdo é muito bacana! Já podemos perceber pelos textos anteriores que a PCR Real Time é uma excelente ferramenta diagnóstica, mas é importante ter alguns cuidados na interpretação. Antes de seguirmos, preciso reforçar que o alvo de detecção desse exame é o material genético do patógeno que está sendo investigado. Pensando nisso, seguem algumas dicas para auxiliar seu raciocínio diagnóstico diante de um resultado de PCR Real Time:

Dica 1: O resultado positivo! Quando o resultado positivo correlaciona com a suspeita clínica, parabéns! Você fechou o diagnóstico! Mas atenção, o positivo também pode ocorrer em animais infectados que ainda não iniciaram a sintomatologia clínica. Isso é um fato que demonstra a precocidade de detecção do exame, que é uma das grandes vantagens em relação aos ensaios sorológicos, que demandam soroconversão do animal para evidenciarem resultado compatível. Existe também outras situações de resultado positivo onde o animal infectado permanece assintomático porque houve resposta imunológica eficiente e o agente foi eliminado antes de haver evidência clínica. Por último, em alguns cenários que são relativamente comuns para as infecções virais, o positivo pode aparecer em um animal portador subclínico. Esses animais tem o agente infeccioso e dispersam ele pelo ambiente, entretanto, não desenvolvem a doença!

Dica 2: O resultado negativo! O negativo pode ser considerado para excluir a suspeita clínica, desde que a amostra seja condizente com o tropismo infeccioso do agente em questão. Funciona assim, a coleta da amostra tem que estar relacionada com as vias de disseminação do patógeno. É essencial que também seja determinada a fase clínica que o animal apresenta, pois ela pode refletir amostragens diferentes para o diagnóstico de um mesmo patógeno. Na dúvida, o TECSA tem um Manual de Coletas sempre atualizado que especifica as amostragens cabíveis para as várias reações de PCR Real Time disponíveis. Você pode ainda ligar na assessoria científica e tirar dúvidas. Temos uma equipe de veterinários bastante capacitados para te orientar melhor!

Dica 3: Existe falso-positivo ou falso-negativo? Vamos lá, existem vários controles para a reação de PCR Real Time, desde a extração de ácidos nucleicos até o processo final de amplificação. O TECSA também investe massivamente em automação! Os processos ocorrem em sistemas fechados e com máximo de vigilância possível! Enfim, isso é para te assegurar que não existe o falso-positivo (ufa!)! Por outro lado, o falso-negativo pode ocorrer em algumas situações. Por exemplo, caso você esteja investigando um patógeno bacteriano ou fúngico em um paciente que está em tratamento com antibióticos ou antifúngicos, pode ser que haja um falso-negativo. Basicamente, porque o agente não vai estar mais disponível para detecção. Outra situação ocorre quando a amostra não é armazenada de forma adequada, isso pode gerar degradação dos ácidos nucleicos e inviabilizar a detecção. Lembre-se sempre de armazenar a amostra coletada em geladeira (2-8°C) ou freezer (-20°C). Quando for armazenar por até 72 horas, pode considerar geladeira, mas para armazenamento em períodos maiores (1-2 meses), congele a amostra! Ah, e envie sob refrigeração para o laboratório!

 

TRÊS MITOS SOBRE O PCR REAL TIME

Esse tópico vai ser servir para “quebrar” alguns conceitos que talvez já tenha ouvido falar sobre a técnica de PCR Real Time! Vamos lá!

Mito 1: PCR Real Time é muito caro!

Essa com certeza muitos colegas já ouviram! E quer saber, até bem pouco tempo atrás, realmente havia um custo alto associado a execução dessa técnica, e em virtude da baixa demanda, os preços dos exames eram bem elevados! Isso fazia com o que esse exame fosse encaixado somente quando os demais, de custo mais reduzido, não fossem conclusivos sobre o diagnóstico. A boa notícia é que os preços caíram muito (e vão continuar caindo!), particularmente para as reações de PCR Real Time oferecidas pelo TECSA Laboratórios. A ideia é propiciar aos clientes exames de elevado valor tecnológico para entrarem na composição primária da linha de raciocínio diagnóstica. Acho que já falei dos painéis multiplex nos textos anteriores né, pois é, eles são também chamados de painéis inteligentes, porque além de te ajudar no diagnóstico diferencial, são oferecidos com preços ainda mais reduzidos comparados ao montante do valor das reações individuais!

Mito 2: O resultado do PCR Real Time demora muito!

Esse é outro grande equívoco! As reações de amplificação demoram média de 2-3 horas para serem concluídas. Como o resultado pode ser acompanhado em tempo real, isso significa que ele é produzido igualmente rápido. O processo de extração de ácidos nucleicos também toma um tempinho, mas hoje, com o processo automatizado, o TECSA Laboratórios produz 96 extrações em apenas 1:30h. Isso sem contar, que o processo ocorre em sistema fechado e com rendimento elevadíssimo, sempre atrelado ao máximo de qualidade! Fique tranquilo que brevemente, sua percepção da redução dos prazos de entrega vai ser cada vez maior!

Mito 3: PCR Real Time é tudo igual!

Ah, mas não é mesmo! Já vimos que o PCR Real Time difere muito do PCR convencional, especialmente pelo conjunto de vantagens que oferece! Agora, é importante saber que também existem diversas técnicas para PCR Real Time. Falaremos melhor desse tópico depois, mas só pra dar um pequeno “spoiler”, as principais variações consideram os métodos SYBR Green e TaqMan. Sabe qual é o melhor? O método TaqMan (Dica TECSA: todos nossos exames PCR Real Time utilizam sondas TaqMan)! Você ganha ainda mais em sensibilidade, especificidade e viabilidade de reações Multiplex! Mais pra frente, vamos ter um tópico pra falar apenas sobre métodos de PCR Real Time e você vai entender melhor!

 

O QUE SÃO PAINÉIS MULTIPLEX?


Aposto que em algumas vezes você tenha ficado receoso de sugerir uma suspeita mais concreta por conta de inespecificidade clínica, estou certo? Isso é normal, muitos patógenos apresentam mecanismos de patogenicidade parecidos e cursam com lesões direcionadas para mesmo órgão ou sistema. Só, que ao mesmo tempo, fica difícil trabalhar os diagnósticos diferenciais por vários motivos diferentes, tais como condição financeira do tutor, amostragem dificultosa ou de pequeno volume, ou até mesmo animais de prognóstico ruim, que não permitem que seja dispensado muito tempo para fechar diagnóstico.

Uma alternativa fantástica para otimizar sua rotina diagnóstica são as reações PCR Real Time Multiplex. Através delas, você pode fazer diagnóstico múltiplo de agentes infecciosos em uma mesma reação, e a partir de uma mesma amostra, lembrando que as reações de PCR Real Time podem ser conduzidas com volumes bem pequenos. Vou exemplificar com uma situação bem recorrente. Existem vários hemoparasitas que causam enfermidades com sinais clínicos comuns. Ao solicitar um Painel Hemoparasitas por PCR Real Time Multiplex, você assegura precisão diagnóstica ao considerar todos os diferenciais mais prováveis para aquele quadro clínico. Dessa forma, você ganha em acurácia nos resultados e ainda considera a possibilidade de detectar coinfecções, o que geralmente dificulta o diagnóstico e compromete o tratamento. Além disso, ao contratar os painéis multiplex, que não são chamados de “painéis inteligentes” à toa, o custo total sai bem mais barato que se fosse solicitar as reações individuais.

Vale muito à pena tirar uma parte do seu tempo para se inteirar dos painéis que o TECSA Laboratórios fornece! Temos painéis respiratórios, neurológicos, diarreia, aborto, doador sanguíneo, hemoparasitas, dermatopatias fúngicas, anemia e retroviroses (incluindo DNA proviral). Uma dica importante é que todos nossos painéis de diagnóstico PCR Real Time Multiplex foram compostos com sugestões das principais referências clínicas veterinárias do país, e também foram baseados em estudos epidemiológicos consistentes que correlacionam os patógenos realmente representativos para impacto infeccioso em cães e gatos no Brasil.

 

A INFLUÊNCIA DA MÃO DE OBRA ALTAMENTE ESPECIALIZADA NA BIOLOGIA MOLECULAR

O diagnóstico molecular é alvo de inúmeros avanços tecnológicos. Todos os processos são constantemente evoluídos para caracterizar reações cada vez mais rápidas e com custos mais acessíveis. Hoje, temos equipamentos sofisticados que associam automação à softwares intuitivos, com repertório diverso de análises, sejam de pequena ou até mesmo, grande complexidade.

Analisando esse cenário, dá impressão que os processos tenham adquirido maior simplicidade de manuseio, como se qualquer profissional da área de saúde com mínimo de perícia em pipetagem fosse capaz de conduzir uma análise. Mas só parece, né?! A real proposta da evolução tecnológica é assegurar mínimo de interferência humana nos processos, garantindo eficácia, reprodutibilidade e ausência de contaminações. Isso em contar em ganhos em rapidez de resultados!

Agora, falando da mão de obra em si, os profissionais que conduzem as análises de biologia molecular demandam elevado grau de especialização. Isso impacta diretamente na qualidade das reações que são introduzidas e oferecidas aos clientes. Esses profissionais demandam conhecimentos bem aprofundados em diagnóstico molecular e análises de bioinformática. Toda reação de PCR Real Time, ao ser concebida, demanda um estudo muito elaborado sobre o genoma do patógeno-alvo, suas regiões de maior conservação gênica e desenho de várias pequenas sequências de complementariedade para compor o conjunto de primers e sondas.

Essas sequências são amplamente analisadas em programas de bioinformática antes de serem selecionadas. Após, são introduzidas para análises em bando de dados para averiguação de interferência com as diversas espécies ou subespécies geneticamente similares! Ufaaa, dá um trabalhão né, mas não para aí não! Ao serem sintetizados, os primers e sondas são validados em sucessivas reações com controles gênicos sintéticos e amostras biológicas sabidamente positivas. Somente após certificarmos eficácia, reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade elevadas nas avaliações, é que validamos a reação para ser oferecida ao cliente.

Acho que agora deu para entender a pertinência da mão de obra altamente especializada para conduzir um setor de Biologia Molecular. E sabe o que é melhor? O TECSA Laboratórios possui dois doutores em Diagnóstico Molecular em sua equipe, e eu sou um deles. Estamos sempre à disposição para te garantir a melhor experiência em medicina laboratorial veterinária!

 

QUAL A INFLUÊNCIA DE MULTIPLEX MUITO ABRANGENTE?

Esse é um assunto muito interessante! Vou dar uma aprofundada para que você possa entender melhor a metodologia e saiba inferir sobre fatores que influenciam a aplicação dessa ferramenta incrível.

Por definição, o PCR Real Time Multiplex (Multiplex qPCR) corresponde à amplificação simultânea de mais de uma sequência alvo em uma mesma reação. A amplificação e detecção de vários alvos DNA ou RNA em uma mesma reação oferece muitos benefícios:

1. Custos reduzidos: os alvos são amplificados juntos, ao invés de separadamente, otimizando o uso de reagentes mais caros (dNTPs, enzimas, controles endógenos, etc.).

2. Resultados confiáveis: a coamplificação elimina a variabilidade entre tubos ou poços. A qualidade dos dados pode ser assegurada porque a região alvo de interesse é normalizada através de inserção de controle endógeno (amplificação de sequência do genoma do hospedeiro) dentro da mesma alíquota da amostra.

3. Conservação de amostras preciosas (limitantes): obtenha mais dados por amostra. Quando a quantidade de amostra é limitada, a multiplexação permite que mais alvos sejam analisados usando uma única alíquota de amostra.

4. Maior rendimento: mais alvos podem ser analisados por reação.

Legal, né?! Acho que já consegui te convencer do quão fantástico e versátil pode ser o Multiplex qPCR! Mas agora, é fundamental que você compreenda alguns “poréns” para que tenha maior confiabilidade nas suas solicitações!

A otimização das condições de uma reação PCR Real Time Multiplex é muitas vezes laboriosa e requer muito tempo. Como existem vários primers e sondas dentro do mesmo tubo, é imprescindível que a reação multiplex não altere a sensibilidade das reações individuais. Veja bem, é fácil de entender, imagina uma mesa de brigadeiros para uma festa com 4 crianças e, a mesma mesa de brigadeiros para uma festa com 15 crianças. Pois é, a disputa por brigadeiros aumenta, né?! E pode ser, que não haja brigadeiros para todo mundo, o que pode ser bem chato! Agora, imagina reações multiplex com uma grande quantidade de patógenos alvo, vai funcionar da mesma forma! Alguns estudos já conseguiram montar multiplex qPCR para até 40 alvos gênicos diferentes, mas a sensibilidade cai demais e os exames perdem muito em capacidade diagnóstica, principalmente se a quantidade inicial de genoma pesquisado for pequena na amostra.

Essa dica é muito legal! Desconfie sempre desses painéis multiplex que oferecem muitos itens de detecção (particularmente, os acima de 10 alvos). Parecem muito atrativos inicialmente, mas acaba sendo um “mau uso” de uma ferramenta poderosa. Ah, reserve um pouco do seu tempo para averiguar a pertinência de investigar alguns patógenos. Algumas empresas multinacionais oferecem painéis que incluem pesquisa de agentes que não tem significância epidemiológica no Brasil, e isso não faz sentido!

Depois de te “preocupar” um pouco, agora eu vou te “tranquilizar”, rs! Os painéis PCR Real Time Multiplex do TECSA são realmente “inteligentes” e além de estarem vinculados a estudos sérios de epidemiologia de doenças infecciosas no Brasil, foram criteriosamente avaliados junto às principais referências clínicas da atualidade. Isso, sem mencionar, que todos os nossos painéis são certificados para garantir que não haja interferência na sensibilidade das reações! Deu trabalho para deixar tudo “redondinho”. Vale muito à pena conferir! Tudo foi feito com muito carinho, pensando sempre em tornar sua rotina diagnóstica mais fácil e assertiva!

 

A IMPORTÂNCIA DE EQUIPAMENTOS DE PONTA NA BIOLOGIA MOLECULAR

Os rápidos avanços em biologia molecular não só revolucionaram a detecção de microrganismos infecciosos, mas também nossa compreensão da base genética da doença. A detecção precoce de enfermidades levou ao desenvolvimento de novas opções de tratamento, medicamentos direcionados e melhor atendimento ao paciente.

Vamos direcionar o raciocínio para PCR ... pensa o quanto já avançamos em relação ao PCR convencional. Esse processo antigo é praticado muitas vezes com extração de ácidos nucleicos manual, com reagentes produzidos in house (com pouco ou nenhum controle de qualidade), seguida de ciclos longos de amplificação (algumas vezes acima de 4 horas!) e vários processos de manipulação pós-amplificação, como preparo de gel de agarose, eletroforese das amostras amplificadas e leitura em transiluminador UV. Isso demora muito, fora que o risco de contaminação é grande em várias etapas ... e também parece meio arcaico, né?! Os avanços tecnológicos que vieram com o PCR Real Time são refinamentos de métodos existentes que os tornam mais rápidos, mais sensíveis, mas específicos e muito mais eficientes.

Para contextualizar, vou detalhar as inovações em PCR Real Time e os benefícios relacionados.

1. Extração de Ácidos Nucleicos: Etapa muito crítica! Eu acenderia um alerta vermelho para vários processos dessa etapa, mas ainda bem que contamos com kits e equipamentos altamente tecnológicos para otimizar e minimizar riscos da extração. Nosso processo de extração hoje é totalmente automatizado em sistema fechado, o que já vimos nos textos anteriores que assegura ausência de contaminação, elimina riscos de falha humana e agiliza (... e muito!!!) o tempo dispensado para obter os ácidos nucleicos. Os kits empregam tecnologia de beads magnéticas (método mais avançado disponível!) que resultam em maior rendimento e grau de pureza para as extrações. Para certificar rendimento satisfatório, todas as amostras são avaliadas e quantificadas em equipamento de fluorimetria para DNA, RNA e proteínas. Ainda, para certificar eficácia do processo, todas as amostras extraídas são igualmente avaliadas para controles endógenos, que são direcionados para segmentos gênicos específicos do animal de origem da amostra.

2. Preparo de reações PCR Real Time: Os kits de enzimas para amplificação são outro show à parte! Existe um mecanismo de cores para o processo de pipetagem, que garante a correta dispensação de reagentes e amostras durante o preparo das reações. Os reagentes apresentam estabilidade em temperatura ambiente (favorece flexibilidade e segurança no preparo das reações). Agora o melhor, é que a tecnologia empregada permite eficácia, especificidade e sensibilidade superiores comparadas com outros kits, e ainda permite ciclagens ultrafast, que favorecem maior agilidade e eficiência de desempenho no equipamento de amplificação.

3. Amplificações PCR Real Time: Nessa etapa, os equipamentos de ponta fazem muita diferença! Os equipamentos empregados possuem alta performance, baixa manutenção, elevada uniformidade térmica e óptica (importante para assegurar acurácia de ciclagens e leituras de fluorescência), além de permitir múltiplas aplicações de uso. Possuem vários canais de detecção óptica, que propicia execução e otimização de reações multiplex PCR Real Time. O software de operação permite rastreabilidade de todos os processos, análises quantitativas, gráficos de desempenho, tudo interligado para aumentar a confiabilidade dos resultados.

 

Parece propaganda de margarina, né?! Só tem coisa boa mesmo? Sim, por incrível que pareça! Cada inovação tecnológica que consideramos para ser introduzida no setor Molecular Services do TECSA Laboratórios é criteriosamente avaliada e validada antes. E o principal motivo de tudo no TECSA ser pensado para ser o melhor, é porque nosso cliente sempre merece o melhor!

 

Dr Otávio Valério de Carvalho

MV-PhD – Diretor Técnico

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